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產(chǎn)地 | 國內(nèi) |
品牌 | 上海滬崢 |
貨號(hào) | HZW0699 |
用途 | 僅限科研 |
包裝規(guī)格 | 48T/盒 |
純度 | 詳詢客服% |
CAS編號(hào) | |
是否進(jìn)口 |
豬流感(SIV)核酸檢測試劑盒(RT-PCR熒光探針法)
操作步驟
1 病毒 RNA 的提取
1.1 取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照,分別加入裂解液 600 μL,充分顛倒混勻,室溫靜置 3~
5 min。
1.2 將液體吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管,吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì),以免離心時(shí) 堵塞吸附柱),13000 rpm 離心 30 s。
1.3 棄去收集管中液體,加入 600 μL 洗液,13000 rpm 離心 30 s。
1.4 重復(fù)步驟 1.3。
1.5 棄去收集管中液體,13000 rpm 空柱離心 2 min,以除去殘留的洗滌液。
1.6 將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中,向柱中央加入洗脫液 50 μL,室溫靜置 1 min,13000 rpm
離心 30 s,離心管中液體即為模板 RNA。
2 實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 操作
設(shè)被檢樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照總和為 N,則反應(yīng)體系配制如下: 試劑 體系
無菌無核酸酶水 2.7(N+1)μL
RT-PCR 反應(yīng)液 10(N+1)μL
酶混合液 0.4(N+1)μL
熒光探針 1.9(N+1)μL
將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后,分裝每個(gè)反應(yīng)管中各 15 μL。
分別取 5 μL 模板 RNA,加入相應(yīng)反應(yīng)管中,混勻并作好標(biāo)記,在熒光 PCR 儀上進(jìn)行以下反應(yīng):
45 ℃ 15 min,95 ℃ 1min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,在每個(gè)循環(huán)第二步(60℃ 35s)收集熒光信號(hào),共
40 個(gè)循環(huán)。(報(bào)告基團(tuán)“FAM”,淬滅基團(tuán)“None”)。
結(jié)果判定
1 結(jié)果分析條件設(shè)定 閾值設(shè)定原則:閾值線設(shè)定于剛好超過陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音
情況進(jìn)行調(diào)整。
豬流感(SIV)核酸檢測試劑盒(RT-PCR熒光探針法)2 結(jié)果描述及判定
陽性對(duì)照 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線,陰性對(duì)照無 Ct 值并且無特定擴(kuò)增曲線,實(shí)驗(yàn)結(jié)果成 立;被檢樣品 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為 AIV 陽性;被檢樣品 30<Ct<37 并出現(xiàn)特定的擴(kuò) 增曲線,需重新取樣提取 RNA,擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定,如仍是可疑,可判定為陽性;被檢樣品 Ct 值≥37 時(shí),超過本方法檢測靈敏度范圍,判定為陰性;對(duì)于某些未呈現(xiàn) S 型曲線,但本底較高的樣 品,應(yīng)為陰性。